| 1. 言 复方duo粘菌素B软膏为硫酸duo粘菌素B、硫酸新霉素、杆菌肽和盐酸li多卡因组成的复方制剂，用于预防皮肤割伤、擦伤、烧烫伤、手术伤口等皮肤创面的细菌感染及暂时缓解疼痛等不适症状。硫酸duo粘菌素B为多肽类抗生素，通过干扰细菌膜通透性与核糖体功能而导致细菌死亡，对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、嗜血杆菌等有良好的抗菌作用。硫酸新霉素为氨基糖苷类抗生素，可阻碍细菌核糖体30S亚基相联结的蛋白质合成，引起其遗传密码错读而导致细菌死亡，抗菌谱较广。杆菌肽为多肽类抗生素，通过抑制细菌细胞壁粘肽的合成而导致细菌死亡，主要对革兰氏阳性菌尤其对常见的金黄色葡萄球菌和各种链球菌抗菌活性强，对革兰氏阴性球菌和某些放线菌、螺旋体、阿米巴原虫也有一定的抑制作用。盐酸li多卡因为酰胺类局部麻醉药，其作用机制为阻止神经脉冲的发生、传导与传播。 
duo粘菌素B和杆菌肽作为多肽类抗生素，通常采用液相色谱紫外检测器法或微生物法测定。而硫酸新霉素的紫外吸收较弱，一般采用通用型检测器进行分析。盐酸li多卡因则采用另一种液相色谱紫外方法进行检测。因此对于该复方制剂，可能需要2~3种液相色谱检测法来分析其主要成分，其质控流程较为繁琐和耗时。也有研究采用HPLC-ELSD法来分析上述4种主要物质，但该方法易受到复杂基质的影响，灵敏度和重复性往往不能满足检测需求。 本应用尝试采用HPLC-CAD法对这4种主要成分同时进行检测分析，考虑到这4种主要成分有的缺乏紫外生色团，有的紫外吸收波长较低，易受干扰。但这4种主要成分通常不挥发，电雾式检测器（CAD）非常适合作为主要的检测手段。与蒸发光散射检测器（ELSD）或示差折光检测器（RI）相比，CAD可兼容梯度洗脱，具有更高的灵敏度，可降低复杂基质的干扰。 duo粘菌素B结构式： 硫酸新霉素结构式： 
杆菌肽结构式： 盐酸li多卡因结构式： 
2. 实验方法 2.1 仪器 Thermo Fisher Vanquish Core高效液相色谱仪，泵：Quaternary Pump C，自动进样器：Split Sampler CT，柱温箱：Column Compartment C，CAD检测器：Vanquish CAD H。色谱软件：变色龙Chromeleon 7.3 2.2 试剂 乙腈、甲酸、三氯yi酸（色谱，Fisher），去离子水（18.2 MΩ@25°C，Millipore纯水机）。 2.3 仪器 硫酸duo粘菌素B、硫酸新霉素、杆菌肽和盐酸li多卡因 2.4 样品 市售复方duo粘菌素B软膏 2.5 色谱条件 色谱柱：Phenyl 4.6mm×250mm，5 µm
柱温：40°C
检测器参数：蒸发温度50℃，采集频率5Hz，Filter 3.6s，PFV 1.0
进样量：5µL
流动相A：40mM三氯yi酸，B：甲醇， C：乙腈
梯度洗脱：参见表1
流速：1.0 mL/min 
表1：梯度洗脱程序 3. 实验结果 3.1 属性和线性范围 分别取硫酸duo粘菌素B、硫酸新霉素、杆菌肽和盐酸li多卡因适量，用水溶解并稀释得到一系列不同浓度的混标溶液，考察属性和线性情况。各单标溶液及空白溶剂叠加色谱图如图1所示，结果表明该方法条件下各物质分离效果、峰形及峰响应均良好，空白溶液无干扰。 
图1：4种单标及空白（黑色）叠加色谱图 混标溶液的典型色谱图如图2所示，取4~40ppm浓度范围的混标溶液分别进样，绘制标准曲线。 
图2：混标溶液典型色谱图 
图3：各物质的标准曲线 结果显示， 各物质在其浓度范围内线性良好，相关系数均≥ 0.997 
表2：方法线性结果 3.2 灵敏度 将混标溶液不断稀释并进行检测，通过信噪比（S/N）值来考察CAD检测器对硫酸duo粘菌素B、硫酸新霉素、杆菌肽和盐酸li多卡因的灵敏度。如图4所示，当混标浓度为8ppm时，各物质的S/N接近定量限要求；当混标浓度为4ppm时，各物质的S/N接近检测限要求,结果表明HPLC-CAD方法灵敏度较高。 
图4：各物质的检测限（LOQ）和定量限（LOD） 3.3 重复性 取浓度为20ppm的混标溶液连续进样6针后计算各物质峰面积的%RSD，来考察CAD检测器的重复性，结果见表3、图5。 
表3：各物质重复性结果 
图5：重复性结果色谱图 3.4 样品分析 取市售复方duo粘菌素B软膏样品适量，加水混匀，振荡30分钟后离心3分钟，取上清液过微孔滤膜后直接进样分析，实验结果表明样品中各物质峰形，灵敏度及分离度等均符合分析要求（图6）。 
图6：市售样品色谱图 4. 结论 本应用建立一种HPLC-CAD法，可对复方duo粘菌素B软膏中的硫酸duo粘菌素B、硫酸新霉素、杆菌肽和盐酸li多卡因这4种主要成分同时进行检测分析。该方法灵敏度较高，检测限可低至4µg/mL；重复性好，连续6针峰面积%RSD均＜2.5%；基质干扰小，市售产品中的各物质峰基本不受基质影响。本应用方法方便、快捷，可有效提高检测效率，缩短产品质控流程。 |
